Hidrofobinė stulpelių chromatografija
2.Chromatografinis stulpelis (sukimosi tipas)
3.CHROMATOGRAFINIS STLIDAS (vadovas)
*** Kainų sąrašas visumai aukščiau, pasiteiraukite, kad gautume
Aprašymas
Techniniai parametrai
Hidrofobinė sąveikos chromatografija(HIC) yra galinga technika, naudojama daugiausia baltymų atskyrimui ir valymui, ypač toms, kurios turi hidrofobines savybes. Šis chromatografinis metodas pasitelkia diferencinę hidrofobinę sąveiką tarp mėginio molekulių ir nejudančios fazės, leidžiančios atskirti komponentus pagal jų migracijos greitį eliuavimo metu su mobilia faze. Šiame išsamiame straipsnyje mes įsigilinsime į principus, veikimą, programas, pranašumus, trūkumus ir naujausius hidrofobinės sąveikos chromatografijos pažangą.
Parametras
Hidrofobinės sąveikos chromatografijos principai
HIC pagrindas yra baltymų molekulių ir hidrofobinių ligandų, pritvirtintų prie stacionarios fazės, hidrofobinės sąveikos. Baltymai, būdami amfipatijos pobūdyje, turi ir hidrofilinius, ir hidrofobinius likučius. Vandeniniuose tirpaluose hidrofiliniai liekanos linkę susidurti į išorę, sąveikaudamos su vandens molekulėmis, o hidrofobiniai likučiai dažnai palaidojami baltymo tretinėje struktūroje. Tačiau tam tikromis sąlygomis, tokiomis kaip didelė druskos koncentracija, šie hidrofobiniai liekanos gali būti veikiamos, skatinant jų sąveiką su hidrofobiniais ligandais chromatografinėje matricoje.
HIC mobilią fazę paprastai sudaro buferinio druskos tirpalo, kurio pH diapazonas yra 6-8. Hidrofobinėms sąveikoms sustiprinti naudojama didelė druskos koncentracija, palengvinanti baltymų surišimą į nejudančią fazę. Laipsniškas druskos koncentracijos sumažėjimas mobiliojoje fazėje eliuavimo metu padidina skalbimo galią, leidžiančią baltymams išplauti atsižvelgiant į jų hidrofobiškumą. Baltymai, turintys silpnesnę hidrofobinę sąveiką, pirmiausia išplaunami, o po to - stipresnę sąveiką.
Chromatografinė matrica ir mobilioji fazė
|
|
Chromatografinės matricos pasirinkimas yra labai svarbus HIC, nes ji daro tiesioginę įtaką ruožų baltymų atskyrimo efektyvumui ir grynumui. Matricos yra suprojektuotos su silpnais hidrofobiniais ligandais, kad būtų išvengta denatūracijos ir negrįžtamos baltymų adsorbcijos, dažnai stebimos atvirkštinės fazės chromatografijoje. Įprastos matricos apima agarozę, poliakrilamidą ir silicio dioksido pagrindu pagamintus gelius, modifikuotus hidrofobinėmis grupėmis, tokiomis kaip fenilo, butilo ar propilo ligandai. Mobiliosios fazės kompozicija vaidina pagrindinį vaidmenį HIC. Hidrofobinėms sąveikoms skatinti naudojamos didelės druskos koncentracijos, tokios kaip amonio sulfatas ((NH4) 2SO4) arba natrio chloridas (NaCl). Buferio pH yra kruopščiai sureguliuotas, kad būtų išlaikytas baltymų stabilumas, ir optimizuoti prisijungimą prie nejudančios fazės. Buferio koncentracija, paprastai svyruojanti nuo 0. 0 nuo 1 iki 0,05 mol/L, taip pat turi įtakos atskyrimo procesui. |
HIC veiklos procedūra
|
HIC eksploatavimo procedūra apima keletą pagrindinių etapų, įskaitant mėginių paruošimą, pakrovimą, eliuavimą ir chromatografinės kolonėlės regeneraciją. ◆ Mėginio paruošimas: Prieš pakrovimą, mėginiai paprastai sureguliuojami taip, kad atitiktų A mobiliosios fazės (pusiausvyros buferio) druskos koncentraciją ir pH. Tai užtikrina optimalias surišimo sąlygas ir sumažina skiedimo mėginį. ◆ Įkėlimas: Mėginys dedamas į koloną, kur baltymai sąveikauja su nejudančia faze, atsižvelgiant į jų hidrofobiškumą. ◆ Išliejimas: Eliuavimas pasiekiamas palaipsniui mažinant druskos koncentraciją mobiliojoje fazėje, o tai susilpnina hidrofobinę sąveiką ir leidžia baltymams išplėsti didėjančio hidrofobiškumo tvarka. ◆ Regeneracija: Po naudojimo kolonėlė regeneruojama plaunant distiliuotu vandeniu arba tinkamais valymo priemonėmis, kad būtų pašalinti sandariai surišti teršalai ir paruošti kolonėlę vėlesniems važiavimams. |
|
Hidrofobinės kolonėlės chromatografijos metodika
Hidrofobinės kolonėlės chromatografijos metodika apima keletą esminių etapų, įskaitant mėginio paruošimą, kolonėlės pusiausvyrą, mėginio pakrovimą, eliuavimą ir trupmenų surinkimą.
◆ Mėginio paruošimas:
Prieš įkeliant mėginį į kolonėlę, labai svarbu paruošti mėginį, pridedant pakankamai druskos, kad atitiktų mobiliosios fazės A (pusiausvyros buferio) druskos koncentraciją. Mėginio tirpalo pH taip pat turėtų būti pakoreguotas, kad atitiktų adsorbcijos sąlygas.
◆ stulpelio pusiausvyra:
Kolona yra subalansuota su mobilia A faze A, tai yra specifinės pH ir druskos koncentracijos tirpalas buferiniame druskos tirpale. Tai užtikrina, kad nejudanti fazė būtų prisotinta buferio, paruoštas sąveikauti su mėginio baltymais.
◆ Įkelia mėginį:
Paruoštas mėginys įkeliamas į stulpelį. Mėginio tūriui įtakos turi komponentų koncentracija ir terpės surišimo pajėgumas. Praskiestoms mėginiams tiesioginis apkrova yra įmanoma be išankstinės koncentracijos.
◆ Išliejimas:
Išliejimas pasiekiamas palaipsniui mažinant mobiliosios fazės druskos koncentraciją, taip susilpninant baltymų ir nejudančios fazės hidrofobinę sąveiką. Arba eliuavimą galima pasiekti pridedant organinius tirpiklius ar ploviklius prie mobiliosios fazės, kad pakeistumėte jo poliškumą arba išstumtumėte surištus baltymus.
◆ Frakcijų rinkimas:
Išplautos frakcijos renkamos ir išanalizuojamos, siekiant įvertinti tikslinių baltymų grynumą ir atkūrimą.
Veiksniai, darantys įtaką atskyrimui
Keletas veiksnių didelę įtaką baltymų atskyrimo efektyvumui ir grynumui reikšmingai daro hidrofobinėje kolonėlės chromatografijoje:
◆ Druskos koncentracija ir tipas:
Druskos tipas ir koncentracija mobiliojoje fazėje vaidina pagrindinį vaidmenį moduliuojant hidrofobinę sąveiką. Dažniausiai naudojamos tokios druskos kaip amonio sulfatas ir natrio chloridas, kurio koncentracija svyruoja nuo 0. 75–2 mol/L amonio sulfato ir nuo 1 iki 4 mol/L natrio chloridui.
◆ PH:
Mobiliosios fazės pH daro įtaką baltymų krūvio būsenai ir hidrofobiškumui. PH atokiau nuo baltymo izoelektrinio taško yra linkęs į eliuavimą, nes sumažėja hidrofobinė sąveika.
◆ Temperatūra:
Stulpelio temperatūros padidinimas gali sustiprinti hidrofobinę sąveiką, todėl pagerėja atskyrimo efektyvumas.
◆ Srauto greitis:
Srauto greitis daro įtaką baltymų buvimo laikui kolonėlėje, darant įtaką jų sąveikai su nejudančia faze.
◆ stulpelio charakteristikos:
Kolonėlės ilgis, skersmuo ir pakavimo medžiaga prisideda prie atskyrimo efektyvumo. Taip pat labai svarbu pasirinkti nejudančią fazės medžiagą ir jos paviršiaus savybes.
Hidrofobinės sąveikos chromatografijos taikymas
HIC randa išsamų pritaikymą įvairių baltymų, įskaitant baltymus serume, membranomis surištais baltymais, branduoliniais baltymais, receptoriais ir rekombinantiniais baltymais. Dėl švelnių atskyrimo sąlygų jis ypač tinka valyti aktyvias medžiagas, tokias kaip fermentai, antikūnai ir kiti terapiniai baltymai.
|
|
◆ Baltymų gryninimas: HIC dažnai naudojamas kaip poliravimo žingsnis atliekant kitus chromatografinius metodus, tokius kaip jonų mainų chromatografija arba afiniteto chromatografija, siekiant aukšto grynumo lygio. ◆ Antikūnų gryninimas: Monokloninius antikūnus ir kitus imunoglobulinus galima veiksmingai išgryninti naudojant HIC, palengvinant jų naudojimą terapiniame ir diagnostinėje srityje. ◆ Baltymų variantų atskyrimas: HIC gali atskirti baltymų izoformas, aktyvias ir neaktyvias formas ir sutrumpintas rūšis, padedant apibūdinti ir kokybės kontrolę biofarmacijos metu. |
HIC pranašumai ir trūkumai
Privalumai:
1) Aukštas atsigavimo procentas: HIC siūlo aukštą baltymų atkūrimo greitį, todėl jis yra efektyvus didelio masto valymo procesams.
2) Išlaikytas baltymų aktyvumas: lengvos atskyrimo sąlygos sumažina baltymų denatūraciją ir aktyvumo praradimą.
3) Universalumas: HIC gali būti pritaikytas įvairių baltymų, turinčių įvairias hidrofobines savybes, valyti.
Trūkumai:
1) Ribotas tirpumas: Kai kuriems baltymams gali būti sumažintas tirpumas esant didelei druskos koncentracijai, todėl jų pritaikymas yra susijęs su HIC.
2) Druskos trukdžiai: Didelė druskos koncentracija mobiliojoje fazėje gali trukdyti vėlesniems analitiniams etapams, todėl reikia papildomų švilpimo procedūrų.
Naujausi pasiekimai ir ateities kryptys
Naujausi HIC pasiekimai buvo sutelkti į naujų chromatografinių matricų, turinčių padidėjusį atskyrimo efektyvumą ir stabilumą, plėtrai. Hidrofilinės sąveikos chromatografijos (HILIC) principų įtraukimas ir mišrių režimų dervų naudojimas išplėtė HIC pritaikymą polinių junginių atskyrimui.
Be to, HIC integracija su kitais chromatografijos metodais, tokiais kaip jonų mainų chromatografija ar dydžio išstūmimo chromatografija, palengvino efektyvesnių ir tvirtesnių valymo protokolų kūrimą. Automatizavimo ir didelio pralaidumo atrankos technologijų pažanga taip pat prisidėjo prie HIC procesų mastelio ir atkuriamumo.
Ateities HIC tyrimų kryptys apima alternatyvių ligandų ir matricų tyrinėjimą, siekiant dar labiau pagerinti atskyrimo efektyvumą ir išplėsti taikymo sritį. Ekologiškesnių ir tvarių mobiliųjų fazių kūrimas, taip pat eliaminimo sąlygų optimizavimas siekiant sumažinti baltymų denatūraciją išlieka nuolatinių tyrimų sritys.
Apibendrinant galima pasakyti, kad hidrofobinė sąveikos chromatografija yra universali ir veiksminga baltymų atskyrimo ir gryninimo priemonė, ypač turintys hidrofobines savybes. Pasitelkdamas diferencinę hidrofobinę sąveiką tarp mėginių molekulių ir nejudančios fazės, HIC leidžia valyti aukštos kokybės baltymus įvairioms terapinėms, diagnostinėms ir tyrimų pritaikymams. Tęsdamas chromatografinių medžiagų, automatizavimo ir integracijos į kitus metodus pažangą, HIC ateitis žada dar didesnį efektyvumą ir platesnį pritaikomumą biofarmacijos srityje.
Populiarus Žymos: Hidrofobinė stulpelių chromatografija, Kinijos hidrofobinių kolonų chromatografijos gamintojai, tiekėjai, gamykla
Siųsti užklausą
